Колекція малярства (понад 2,5 тис. од. зб.) почала формуватися у Київському музеї стоарожитностей та мистецтв завдяки діяльності М. Біляшівського, Д. Щербаківського, Ф. Ернста, колекціонерів та меценатів. Зібрання портретного та історичного малярства започаткувала колекція полотен з галереї Вишневецького замку (нині Тернопільська обл.), у 1899 р. подарована Києву родиною Толлі.
В музеї також зберігаються портрети гетьманів, козацької старшини, церковних діячів у копіях ХІХ ст.
Від відомого історика М. Костомарова до музею надійшов портрет І. Мазепи («Напольний гетьман»), а проф. В. Антонович подарвав копію донаторського портрета І. Гонти із Воздвиженської церкви м. Володарки на Київщині, про що свідчить запис на його підрамнику «Снят с подлинника, хранящегося у Вл. Б. Антоновича в Киеве». Завдяки О. Лазаревському у музеї зʼявилася копія портрета кн. Раїни Могилянки, виконана худ. Я. Сваричевським із оригіналу поч. ХVІІ ст.
Як свідчать архівні документи 1911–1929 рр., до музейного зібрання надходили живописні полотна із приватних колекцій, зокрема родини Тарновських.
Авторські роботи у зібранні представлені портретами роботи художників П. Рогулі (Петро І, 1744), Я. Аргунова (В. Розумовська, 1824), В. Галімського (Д. Чечель, 1898), Г. Гольпайна (київський губернатор І. Фундуклей, 1845).
В зібранні представлені жанрові полотна, зокрема «Сандомирський рокош 1606 року» (поч. XVII ст.).
Живопис XIX–XX ст. представляють роботи І. Їжакевича, С. Світославського, І. Труша, М. Глущенка, І. Тартаковського, А. Волненка, О. Куриласа, Ф. Коновалюка, М. Дерегуса, О. Горбенка, С. Шишка, етюди І. Бурячка, В. Кричевського, В. Орловського, С. Васильківського, Т. Яблонської.
Зібрання активно поповнювалося у 1923–1933 рр., коли мистецький відділ очолював Ф. Ернст. У цей час була сформована колекція «полоніки» – бл. 100 полотен, створених польськими майстрами на теренах України: портрети державних діячів Речі Посполитої, Князівства Варшавського та Царства Польського, жанрові картини на теми польської історії.
З колекції Церковно-археологічного музею Київської духовної академії походить низка портретів гетьманів України, церковних діячів, меценатів.
Гордістю НМІУ є колекція ікон ХVІ–ХVІІІ ст. із Середнього Подніпровʼя, Волині, Галичини. У 1913 р. Д. Щербаківський придбав для музею ікону «Святий Димитрій», а у 1916 р. привіз із експедиції ікону «Чудо святого Георгія про змія». Ікону «Собор архангела Михаїла» у 1916 р. до Київського художньо-промислового і наукового музею подарував священик Покровської церкви с. Малі Горошки на Волині.
Деякі ікони надійшли до музею у 1946 р. після повернення в Україну колекцій, вивезених до Німеччини.
Перлиною музейного зібрання є образ Любецької Богородиці з колекції П. Потоцького, у 1698 р. створений відомим українським майстром І. Щирським.
У 1934–1935 рр., після поділу Всеукраїнського історичного музею на Державний музей українського мистецтва (нині НХМУ) та Державний республіканський історичний музей (нині НМІУ) до НМІУ надійшов історичний живопис та частина портретної колекції із зображеннями представників української та польської шляхти, російських урядовців.
Шляхами поповнення живописної колекції були експедиції, подарунки приватних осіб, конфісковані твори, передачі відповідних установ. Найбільшою стала передача 1950-х рр. Києво-Печерським заповідником низки сакральних творів та портретів прилуцького полковника І. Стороженка, імператора Павла І, канцлера Великого князівства Литовського К. Сапєги, фельдмаршала М. Кутузова та Петра І з родиною (1712–1717); останній походить з Видубицького монастиря.
У 1950-х – 1970-х рр. кількість експонатів продовжувала зростати як за рахунок передачі державними установами та окремими авторами, так і завдяки закупівлям Міністерством культури УРСР. В цей час колекцію збагатили твори М. Глущенка, І. Їжакевича, І. Тартаковського, С. Шишка, Ф. Коновалюка, А. Волненка.
Протягом двох останніх десятиліть колекція поповнювалася переважно полотнами-дарунками авторів та за рахунок передач правоохоронних органів країни. В музейному зібранні з’явилися твори українських живописців ХХ – поч. ХХІ ст. О. Лопухова, С. Подерев’янського, С. Григораша, В. Чуприни, Н. Лопухової, Ф. Гуменюка.
